Estrategias para mejoramiento de expresi?n de prote?nas en el cloroplasto de Chlamydomonasreindhardtii
- Authors
- Carrera Pacheco, Saskya Estefany
- Format
- MasterThesis
- Status
- publishedVersion
- Description
World population will demand 70% more food and 50% more energy and water by 2050, promising green alternatives, such as microalgae can be engineered to produce biomass for animal and human food, high valuable products (e.g. therapeutic proteins, hormones, antibodies), industrial enzymes and biofuels. However, recombinant protein production is poorly developed, and no efficient system is known for transgene expression. Combinatorial approach, where different cis-acting elements are tested, showed to be the strategy to improve foreign protein production in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast. The endogenous Prrn promoter and four 5?-UTRs belonging to the major capsid protein gene of cyanophages P-SSP7, Pf-WMP4, P-SSM2 and P-SSM4 were fused to the reporter gfp gene. In addition, a stabilizing element was included upstream the 5?-UTR of three of the four cyanophages translation control signals employed to theoretically prevent mRNA from degradation. Bacterial system was employed to generate the final transformation vectors, which were transformed into algae by biolistic bombardment. TSP and Native-PAGE were used to screen for GFP expressing colonies. Results showed absence of GPF fluorescence in the algal system, therefore new constructs including chloroplast codon optimized gfp were built expecting 80-fold increase in protein expression. However, similar results were obtained, suggesting two possible scenarios: possible incompatibility of the prokaryotic translation control signals with Chlamydomonas reinhardtii chloroplast gene expression machinery or negative effect of the stabilizing element over gene expression. Thus, additional experiments are being conducted employing the hairpin structure and endogenous 5?-UTR in order to clarify its real contribution to transgene expression. Overall, understanding how these components cooperate with each other in order to accomplish chloroplast translation will help elucidate how gene expression works in C. reinhardtii chloroplast.
Para el 2050 la poblaci?n mundial demandar? 70% m?s comida, 50% m?s energ?a y agua. Las microalgas se muestran como alternativas verdes prometedoras, pudiendo ser modificadas gen?ticamente para producir biomasa para alimento humano y animal, productos de alto valor comercial (prote?nas terap?uticas, hormonas, anticuerpos), enzimas industriales y biocombustibles. Sin embargo, la producci?n de prote?nas recombinantes est? pobremente desarrollada, y aun no se conoce un sistema de expresi?n de transgenes eficiente. El enfoque combinatorio en donde diferentes elementos 'cis-acting' son evaluados, ha demostrado ser la estrategia para mejorar la producci?n de prote?nas for?neas en el cloroplasto de Chlamydomonasreinhardtii. El promotor end?geno Prrn y cuatro 5'-UTRs pertenecientes al gene de la prote?na de c?pside de los cianofagos P-SSP7, Pf-WMP4, P-SSM2 y P-SSM4 fueron fusionados al gen reportero gfp. Adicionalmente, un elemento estabilizador fue incluido aguas arriba de la regi?n no traducida 5' (UTR) en tres de las cuatro se?ales de control de la traducci?n de los cianofagos, para te?ricamente prevenir la degradaci?n del ARN mensajero. El sistema bacteriano fue empleado para generar los vectores de transformaci?n finales, los cuales fueron transformandos en alga mediante bombardeo biol?stico. Las prote?nas solubles totales y electroforesis en gel de poliacrimida-nativo fueron usados para verificar la presencia de colonias que expresen GFP. Los resultados mostraron ausencia de fluorescencia correspondiente al GFP en el sistema de algas, por lo tanto nuevos pl?smidos fueron creados incluyendo la versi?n de codones optimizada para la expresi?n de gfp en el cloroplasto (80 veces m?s expresi?n). Sin embargo, resultados similares fueron obtenidos, sugiriendo dos posibles escenarios: posible incompatibilidad de las se?ales de control de la traducci?n pertenecientes a procariotas con la maquinaria de expresi?n de genes del cloroplasto de Chlamydomonasreinhardtii, o efecto negativo del elemento de estabilizaci?n sobre la expresi?n g?nica. En general, el entendimiento de como estos componentes cooperan unos con otros para llevar a cabo la traducionen el cloroplasto, pueden ayudar a clarificar como la expresi?n g?nica trabaja en el cloroplasto de Chlamydomonasreinhardtii.
- Publication Year
- 2015
- Language
- eng
- Topic
- BIOLOG?A MOLECULAR
BIOTECNOLOG?A
MICROALGAS
PROTE?NAS RECOMBINANTES
EXPRESI?N DE TRANSGENES
- Repository
- Repositorio SENESCYT
- Rights
- openAccess
- License