Método de marcación genética de plásmidos de Escherichia coli.

 

Authors

Freire Vélez, Ana Lucía

Format

BachelorThesis

Status

publishedVersion

Description

Escherichia coli is part of the intestinal microbiota of warm-blooded animals, and is the primary facultative anaerobe that resides in the human colon. This species has evolved into different pathotypes (ETEC, EPEC, EIEC, EHEC, ExPEC, EAEC) involving the acquisition of pathogenicity islands that can be transferred horizontally by plasmids. The possibility of constant evolution of E. coli pathotypes largely explains the enormous diversity of clones of enterotoxigenic E. coli (ETEC) in defined geographic regions. This project developed a method to tag ETEC plasmids with the Tn5 transposon, by conjugation. We selected mutants of E. coli resistant to nalidixic acid and ciprofloxacin, which served as markers for the selection of transconjugants. Then, by conjugation, we created a library of ETEC mutants using the Tn5 transposon. The first conjugation was made between: Escherichia coli HB101 resistant to kanamycin (Tn5 transposon) and ETEC (LT pathogenicity gene) resistant to nalidixic acid. The second conjugation involved the Conjugate # 1 (nalidixic acid-resistant ETEC + Tn5) which were conjugated with E. coli K12 resistant to ciprofloxacin. Finally the molecular confirmation was conducted by PCR amplification of both the LT gene, and the kanamycin resistance gene (KM). Through conjugation it was possible to tag an unknown ETEC plasmid with the Tn5 transposon. However the tagged plasmid didn´t contain the pathogenicity gene (LT), thus the attempt to identify ETEC mutants with the ability to transfer horizontally the Tn5 failed. The Tn5 transfer to different Escherichia coli strains (ETEC, K12) was confirmed by PCR amplification of the kanamycin resistance gene. The present research investigated the existence of traceable horizontal transfer of plasmids containing pathogenicity genes from ETEC to other E. coli lineages. viii
Escherichia coli forma parte de la microbiota intestinal de los animales de sangre caliente, y es el principal anaerobio facultativo que reside en el colon humano. Esta especie ha evolucionado hacia distintos patotipos (ETEC, EPEC, EIEC, EHEC, ExPEC, EAEC) que involucran la adquisición de islas de patogenicidad que pueden ser transportadas por plásmidos mediante transferencia horizontal. La posibilidad de evolución constante de los patotipos de E. coli explicaría en gran medida la enorme diversidad de clones de E. coli enterotoxigénica (ETEC) en regiones geográficas definidas. En el presente proyecto se desarrolló un método para marcar por medio de conjugación, plásmidos de ETEC con el transposón Tn5. Para ello se seleccionó mutantes de E. coli resistentes al ácido nalidíxico y ciprofloxacina, que sirvieron como marcadores en la selección de los transconjugados. A continuación, por medio de conjugación, se creó una biblioteca de mutantes de ETEC utilizando el transposón Tn5. La primera conjugación se realizó entre: Escherichia coli HB101 resistente a kanamicina (transposón Tn5) con ETEC (gen de patogenicidad LT) resistente al ácido nalidíxico. Para la segunda conjugación, se partió del Conjugado #1 (ETEC resistente al ácido nalidíxico + Tn5) y se lo conjugó con E. coli K12 resistente a ciprofloxacina. Finalmente se llevó a cabo la confirmación molecular, mediante amplificación por PCR tanto del gen LT, como del gen de resistencia a la kanamicina (KM). Mediante conjugación se logró marcar un plásmido de ETEC desconocido con el transposón Tn5. Sin embargo dicho plásmido no contiene el gen de patogenicidad (LT), por lo cual no se logró identificar a mutantes de ETEC con la capacidad de transferir horizontalmente al Tn5. La transferencia del Tn5 a distintas cepas de Escherichia coli (ETEC, K12) se confirmó mediante la amplificación por PCR del gen de resistencia a la kanamicina. La presente investigación buscó determinar si existe transferencia horizontal de plásmidos de patogenicidad de ETEC a otros linajes de E. coli.

Publication Year

2012

Language

esp

Topic

Factores de virulencia
Transposones
CIENCIAS

Repository

Repositorio Universidad San Francisco de Quito

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http://repositorio.usfq.edu.ec/handle/23000/1499

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